1、梯度洗脫的原理是什么？
①梯度洗脫是指在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，達(dá)到有效分離的洗脫方式。梯度洗脫一般采用二元流動(dòng)相，通常為水相和有機(jī)相。
②梯度洗脫時(shí)流動(dòng)相通常由多種不同極性的溶劑組成。梯度洗脫主要原理是通過(guò)調(diào)整不同時(shí)間段流動(dòng)相的極性來(lái)調(diào)節(jié)各個(gè)組分的容量因子K，使得在合適的時(shí)間范圍內(nèi)將各個(gè)組分的保留合理分配，最終實(shí)現(xiàn)最佳分離。
2、影響出峰時(shí)間的因素有哪些？
①流動(dòng)相的pH值主要是影響到分配系數(shù)而導(dǎo)致各組分出峰時(shí)間的不同。
②除此之外，影響出峰時(shí)間的因素還有很多，從分配系數(shù)、容量因子等各個(gè)方面考慮，除了與目標(biāo)化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)有關(guān)，還與流速，壓力，柱溫等液相色譜儀參數(shù)有關(guān)，具體涉及下面幾種因素的影響：
a、目標(biāo)化合物本身，具體包括分子量、結(jié)構(gòu)、化合物類(lèi)型、極性等；
b、流動(dòng)相，具體包括流動(dòng)相構(gòu)成、配比、流動(dòng)相各組分極性，洗脫方式，流速等；
c、固定相，具體包括固定相種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、色譜柱長(zhǎng)度等；
d、分配系數(shù)與容量因子，具體包括化合物在流動(dòng)相與固定相之間的分配情況，柱溫等。
3、怎樣將目標(biāo)物的保留時(shí)間提前？
問(wèn)題描述：用液相色譜儀做某物質(zhì)含量測(cè)定時(shí)，保留時(shí)間太長(zhǎng)，20min左右才出峰，有沒(méi)什么方法可以將保留時(shí)間提前？
可以從通過(guò)改變目標(biāo)組分容量因子K、縮短柱長(zhǎng)、增加柱溫等方式將保留時(shí)間提前，具體可以采取以下方法：
①調(diào)整流動(dòng)相，具體包括調(diào)整流動(dòng)相構(gòu)成、配比、流動(dòng)相各組分極性、洗脫方式、提高流速等。
②調(diào)整固定相，具體包括固定相種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、縮短色譜柱長(zhǎng)度等。
③增加柱溫，降低流動(dòng)相傳質(zhì)阻力等。
4、如何計(jì)算溶劑強(qiáng)度(容量因子)K？
①容量因子指在一定溫度和壓力下組分在兩相中分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。容量因子反映了組分在柱中的遷移速率，又稱(chēng)作分配比，用符號(hào)K表示。
②在容量因子的具體計(jì)算公式中，需要注意的是，容量因子與分配系數(shù)不同，容量因子除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于t’R、tm較Vs、Vm易于測(cè)定，所以容量因子應(yīng)用更廣泛。
5、怎樣改變流動(dòng)相比例來(lái)延長(zhǎng)保留時(shí)間？
問(wèn)題描述：采用C18柱測(cè)定黃酮苷，用甲醇+乙腈+四氫呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流動(dòng)相，分離效果不理想，想通過(guò)延長(zhǎng)保留時(shí)間的方式提高分離度，具體應(yīng)該如何操作？
①甲醇+乙腈+四氫呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流動(dòng)相，流動(dòng)相的pH值可能會(huì)超過(guò)色譜柱的耐受范圍，因此不建議使用。建議直接使用甲醇-水或是乙腈-水作為流動(dòng)相，水相中可以適當(dāng)加點(diǎn)甲酸或是乙酸來(lái)得到最佳分離效果。
②通?？梢酝ㄟ^(guò)降低流速、減小有機(jī)相比例、調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值或更換較長(zhǎng)的色譜柱等方式延長(zhǎng)待測(cè)組分的保留時(shí)間，從而達(dá)到提高組分之間分離度的目的。
6、為什么保留時(shí)間總在變化？
問(wèn)題描述：采用高效液相色譜儀分析苯甲酸時(shí)，流動(dòng)相走了很久，進(jìn)樣以后保留時(shí)間還是不斷漂移，是什么原因造成的？
保留時(shí)間一直在變，說(shuō)明系統(tǒng)沒(méi)有平衡好，可以從多個(gè)方面去排查原因。
①流動(dòng)相可能是最主要的原因，流動(dòng)相平衡時(shí)間是否充足、管路有沒(méi)有氣泡、流動(dòng)相中有機(jī)相是否蒸發(fā)、比例閥工作是否正常。
②泵有可能存在問(wèn)題，輸液是否正常、壓力是否穩(wěn)定、泵密封墊是否完好、是否有漏點(diǎn)。
③色譜柱也需要排查，是否恒溫、是否有漏液。
7、什么是液相色譜的基線(xiàn)？
①當(dāng)色譜柱中僅有流動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的曲線(xiàn)。
②穩(wěn)定的基線(xiàn)應(yīng)該是一條接近于水平的直線(xiàn)，反應(yīng)的是隨著時(shí)間變化的檢測(cè)器系統(tǒng)噪聲值。
8、分離度應(yīng)大于1.5是指什么？
①分離度是衡量色譜柱分離效果的指標(biāo)，它表示相鄰組分色譜峰的分離情況，具體為相鄰組分色譜峰保留值tRI，tRII之差與兩峰寬WI，WII平均寬度之比，用符號(hào)R表示。
②兩峰間距離越大，兩峰越窄，R值就越大，分離的就越好。當(dāng)R=1時(shí)，兩色譜峰交疊約4%，可稱(chēng)為基本分離；當(dāng)R=1.5時(shí)，兩色譜峰交疊約0.3%，可視為相鄰兩組分完全分離。
③分離度要求大于1.5，那就是說(shuō)要求兩種組分完全分離。
9、檢出限和定量限有什么區(qū)別？
問(wèn)題描述：什么是檢出限？什么是定量限？?jī)烧哂惺裁磪^(qū)別？
①兩者的定義如下：
a、檢出限(LOD，Limit of Detection)：分析方法在規(guī)定實(shí)驗(yàn)條件下所能檢出被測(cè)組分的最低濃度或最低量；
b、定量限(LOQ，Limit of Quantification)：分析方法可定量測(cè)定樣品中待測(cè)組分的最低濃度或最低量。
②兩者的區(qū)別如下：
a、檢出限指試樣在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或含量。它是限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，無(wú)需定量測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。
b、定量限指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求。
c、檢出限或定量限的測(cè)定通常是在目標(biāo)物的含量接近于“零”的時(shí)候才需要進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)方法應(yīng)用于所測(cè)定的分析物濃度要比定量限大的多時(shí)，檢出限與定量限評(píng)定就顯的不是非常有必要了。但是對(duì)于那些濃度接近于檢出限與定量限的痕量和超痕量測(cè)試，常報(bào)出“未檢出”時(shí)，這時(shí)檢出限或定量限對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或法規(guī)決策則就顯得非常的重要。
d、不同的基體需要獨(dú)立評(píng)估其檢出限和定量限。
e、通常3倍信噪比是檢出限，10倍信噪比是定量限，但是不同的領(lǐng)域有不同的規(guī)定，測(cè)定檢出限和定量限的方法也不一樣。
10、如何獲得檢出限？
問(wèn)題描述：如何獲得檢出限？有沒(méi)有參考標(biāo)準(zhǔn)？
①可用多種方式獲得檢出限，昌暉儀表羅列了一些常見(jiàn)的獲得檢出限的方法。
a、基于虛擬(Visual)評(píng)估LOD：
Visual評(píng)估可應(yīng)用于非儀器方法和儀器分析方法，同時(shí)也可應(yīng)用于定性測(cè)試方法的評(píng)估。通過(guò)往樣品空白中添加已經(jīng)濃度待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行分析，評(píng)定能夠可靠被檢測(cè)出的最低濃度值。
在樣品空白中加入一系列不同濃度的分析物，在每一個(gè)濃度點(diǎn)需要進(jìn)行約7次的獨(dú)立測(cè)試。各個(gè)濃度點(diǎn)的重復(fù)性測(cè)試應(yīng)該隨機(jī)。對(duì)于定性分析，通過(guò)繪制陽(yáng)性百分比(陰性)與濃度之間的響應(yīng)曲線(xiàn)，檢查確定哪個(gè)濃度閾值是不可靠的。
b、空白標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行評(píng)定LOD
通過(guò)分析大量的空白進(jìn)行評(píng)定(推薦20個(gè)以上)。樣品空白獨(dú)立測(cè)試的次數(shù)(n大于10以上)，以及加入最低可接受濃度的樣品空白測(cè)試次數(shù)(n大于10次以上)。LOD的評(píng)定可用樣品空白平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。
c、基于校準(zhǔn)曲線(xiàn)的LOD評(píng)定
如果LOD數(shù)據(jù)或與LOD相近的數(shù)據(jù)無(wú)法得到，則可利用校準(zhǔn)曲線(xiàn)的參數(shù)進(jìn)行評(píng)估。用空白加上空白的3倍偏差，儀器對(duì)于空白的響應(yīng)可用方程截距a表示，儀器響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差可用校準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sy/x來(lái)表示。故可利用方程yLOD=a+3Sy/x=a+bxLOD，則xLOD=3Sy/x/b。這個(gè)方程廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)。然而由于這是推斷，當(dāng)濃度接近于期望LOD時(shí)，則所測(cè)定的數(shù)據(jù)就會(huì)顯得不那么可靠，建議當(dāng)濃度接近于LOD時(shí)，需要證明要在合適的置信區(qū)間內(nèi)能夠被測(cè)定出來(lái)(可靠地被測(cè)定出來(lái))。
d、基于信噪比LOD
由于儀器分析過(guò)程都會(huì)有背景噪聲，常用的方法就是利用已經(jīng)低濃度的分析物與空白樣品的測(cè)量信號(hào)進(jìn)行比較，確定出能夠可靠測(cè)定出的最小濃度，最典型的可接受的信噪比是2：1或3：1。
②不同領(lǐng)域，獲得檢出限的依據(jù)不一樣，下面羅列了部分參考依據(jù)。
a、GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》；
b、JJG 705-2014《液相色譜儀》；
c、HJ 168-2010《環(huán)境監(jiān)測(cè) 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》；
d、GBZ/T 210.4-2008《職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南 第4部分：工作場(chǎng)所空氣中化學(xué)物質(zhì)的測(cè)定方法》。
